来源：哔哩哔哩
肝脏免疫相关细胞的提取
(相关资料图)
知乎：游子桀
B站：游子桀
2023年8月1日20:42:30 发表于知乎
红细胞裂解液
1 x PBS溶液
Percoll 淋巴细胞分离液
Percoll 储 存液( 100% ) = 90% Percoll 原液 + 10% PBS( 10 × ) 溶液
100% Percoll储存液 用1 x PBS溶液稀释至 70% 或 33%
RPMI 1640,添加 5% 新生牛血清、2 g/L HEPES、2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 μmol/L β-2-巯基 乙醇、50000 U/L 庆大霉素及 1 mmol/L 丙酮酸钠。
附另一种应该具有效果类似的配方(来源：参考文献[2])：
RPMI1640+ 10% 胎牛血清(FCS),青霉素-链霉素溶液( U/ml ),10mM HEPES 缓冲溶液，0,1mM非必须氨基酸溶液(MEM nonessential amino acids)，1mM丙酮酸钠， μM 2-巯基乙醇(2-ME)
摘眼球放血处死后，打开小鼠腹腔，分离肝脏;
(考虑到提取肝脏过程中使用灌流法的目的是为了去除外周血淋巴细胞的影响，根文献[1]摘眼球大量放血可以初步去除外周血的干扰，故此处采取摘眼球放血)
(换句话说，如果实验目的只是为了提取淋巴细胞，并不限定淋巴细胞一定要来源于肝脏组织，那么不放血不灌流，直接处死也是可以的)
1、剪碎肝脏组织，200 目滤网进行研磨，不断加入 RPMI 1640(一种细胞培养基，应该可以与其他类似细胞培养基替换) 保持组织湿润，维持细胞活性。
2、将研磨后的肝组织收集于离心 管中，冰浴自然沉降 10 min 后，吸取上层液体，4 ℃ 800 r/min 离心 5 min，弃上清液。1 × PBS 洗 2 次。
3、3 ml 33% Percoll 溶液重悬沉淀，在另一离心管中加入 70% Percoll 3 ml，用吸管小心将33% Percoll 细胞悬 液叠加于 70% Percoll 溶液上。2400 r/min 离心 25 min，20 ℃，升速 5 降速 1 离心后，用滴管小心吸取 2 层 Percoll 溶液界面的白细胞层至另一离心管中，4 ℃ 800 r/min，离心5 min 收集细胞。1 × PBS 溶液洗 2 次。收集得到的细胞即为淋巴细胞。
步骤3也可以替换为：
直 接 用 3 ml 33 Percoll 溶液重悬细胞，2 400 r/min，25 min，20 ℃，升 速 5 降速 1 离心后，轻轻弃掉中间的肝脏组织团块 和其他残渣，留在管底的是分离得到的小鼠肝脏淋 巴细胞，掺有一定量的红细胞和肝实质细胞。1 ml 红细胞裂解液常温裂解红细胞 10 min 后，4 ℃，800 r/min，离心 5 min，弃上清液。1 × PBS 溶液洗 2 次
但是按文献[1]，双浓度percoll溶液方法提取获得的 NKT 细胞、NK 细胞比例和细胞绝对数更佳。
分离的肝脏淋巴细胞悬液用 2% 冰醋酸 1∶ 20 稀释，显微镜下直接计数后，计算平 均细胞总数。
[1]孔晓明, 金齐力, 韦莉等. 小鼠肝脏淋巴细胞几种分离方法的比较[J]. 蚌埠医学院学报, 2013,38(08):.13898/.
[2]Watarai H，Nakagawa Ｒ，Omori-Miyake M，et al． Methods for detection，isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells［J］． Nat Protoc，2008，3( 1) : 70 － 78．
标签：
